連関資料 :: 酵素の反応速度論
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酵素の反応速度論
- 酵素実験1 目的 私たちの体は摂取した食物を多くの化学反応で変化させながら生命を維持しているこれら無数の反応は、触媒としての酵素の働きにより速やかに進められている。例えば消化酵素で分解したときの速度は、酵素を使わずに分解するよりも数十万倍も速くなる。 酵素反応にはいろいろな特徴がある。この実験では酸性ホスファターゼを用いて、酵素反応の時間経過および基質濃度と反応速度との関係を理解する。 結果 p-NPの検量線 p-NP濃度 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 吸光度 0.0862 0.18375 0.3372 0.5058 0.585 0.68825 検量線の式：y=2.676888x+0.051935 A=2.728823 実験１ ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 吸光度 0.1113 0.0232 0.1249 0.2062 0.1858 0.3098 B(①+②) 0.1345 0.1345 0.1345 0.1345 0.1345 0.1345 補正吸光度(各吸光度-B) -0.0096 0.0717 0.0513 0.1753 p-NP生成量(mM) -0.00035 0.0026 0.0018 0.0064 実験2 試験管番号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ 基質濃度(mM) 2 2.5 3 4 5 1/〔S〕 0.5 0.4 0.33 0.25 0.2 吸光度 0.0269 0.0809 0.1169 0.1226 0.1238 0.1739 0.1688 C=①+② 0.1078 0.1078 0.1078 0.1078 0.1078 0.1078 補正吸光度 0.0091 0.0148 0.0160 0.0661 0.0610 p-NP生成量(mM) 0.2483 0.4039 0.4366 1.8038 1.6646 反応速度v 0.0236 0.0385 0.0416 0.1718 0.1585 1/v 42.373 25.974 24.038 5.8207 6.3091 -1/Km=0.16863 Km=-5.93014 1/Vmax=-21.05962 Vmax=-0.04748 考察 試験管①には緩衝液の他にp-NPPが入っているが酸性ホスファターゼは入っていない。また試験管②には緩衝液の他に酸性ホスファターゼが入っているがp-NPPは入っていない。このような実験を盲検という。③④⑤⑥の吸光度から①と②の吸光度を足した値を差し引いた値が酵素により発色した真の値となる。酵素反応時間とともに、p-NPPが分解して生じたp-NPが発色して吸光度が上昇した。 基質濃度を変えて、酵素反応を調べると、基質濃度が低いときには基質濃度と反応速度は比例して直線関係となるが、基質濃度が高くなると反応速度は一定となってくる。この関係を式で示したのがMichaelis・Mentenの式である。反応速度の逆数を基質濃度の逆数に対してグラフに目盛り、全ての点から最も距離が近い曲線(回帰直線)を引いて、X軸との交点を求めるとその数値は1/Vmaxを示し、Y軸との交点は-1/Kmを示すこのプロットをLineweaver・Burkのプロットという。Kmは基質と酵素との親和性を示し、値が小さいほど基質との親和性は大きい。Vmaxは最大反応速度を示し、これ以上基質濃度が上昇しても酵素の仕事量が限界に達していることを示している。 悩んでみ
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加水分解酵素の反応速度論的解析
- キモトリプシンのinitial burstの測定 目的 酵素キモトリプシンは芳香族アミノ酸(フェニルアラニン,トリプトファン,チロシン)残基のC末端側のペプチド結合を特異的に阻害することが知られている.今回の実験では以下のようにp-nitrophenyl acetate (PNPA)がキモトリプシンに攻撃されることで黄色のp-nitrophenolが生成される. この吸光度変化を測定し,キモトリプシンの活性速度が求められる.p-nitrophenolのモル吸光係数を求め,キモトリプシンの定常状態速度とinitial burst量を計測する. 方法 1.KH2PO4(MW=136,4.08g)を上皿天秤で量り取りビーカーに移し,約250mlの純水を加えて攪拌して溶かした.pHメーターでpHを計りながら固体のKOHを少量ずつ加えた.pH7.0に近くなったら1MのKOHを加えてpHを7.0に合わせ,メスシリンダーに移したのち,純水を加えて最終体積を300mlにし,100mMリン酸カリウム緩衝液を調製した. 2. p-nitrophenol(MW=139,0.0139g)をミクロ天秤で計り,少
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