トリプシン酵素活性の測定

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資料紹介

【目的】
N－α－benzoyl－p－nitroanilideを基質として一定時間反応させた後、分解されて生じたp－nitroanilineの量を405nmの吸光度を測定することによって分解の程度を求める。
また、トリプシンインヒビターの阻害作用をLineweaver－Burkプロットで解析し、その阻害様式を調べる。これらにより、基質濃度を変えたときの酵素反応を調べる。
【方法】
a. マイクロピペットを用いて、ガラス試験管にテキストの表の割合で、試薬を入れていった。
b. 緩衝液を加え、最後にトリプシンを加え、混ぜた。
c. 恒温槽37℃で30分間静置し、反応させた。
d. 恒温槽より取り出し、反応を止めるために45%酢酸250μlを加えた。
e. 吸光度を測定するために、マイクロプレートに200μlずつ入れた。
f. マイクロプレート比色計で405nmの吸光度を測定した。
【結果】
吸光度のデータ
検量線 ①0.2685 ②0.5512 ③0.5828 ④0.8065 ⑤0.9465 ⑥1.0368 酵素活性 ⑦0.2883 ⑧0.681 ⑨0.8153 ⑩0.3425 ⑪0.306 ⑰0.2611 阻害活性 ⑫0.6189 ⑬0.3037 ⑭0.2831 ⑮0.284 ⑯0.3276 ⑱0.2592
ブランクと空気ブランクの平均を引いた値
検量線 ①0 ②0.0226 ③0.0542 ④0.2779 ⑤0.4179 ⑥0.5082 酵素活性 ⑦⁻0.2404 ⑧0.1524 ⑨0.2867 ⑩⁻0.1862 ⑪⁻0.2227 　　－阻害活性 ⑫0.0903 ⑬⁻0.2250 ⑭⁻0.2456 ⑮⁻0.2447 ⑯⁻0.2011 　　－
pNA量(µg)
Y＝0.0258xに吸光度を代入し、酵素活性・阻害活性のpNA量(µg)を出した。
（しかし、何らかの原因により酵素活性、阻害活性の吸光度にマイナスの値が出たためデータとして不適であるのでプラスの値のみデータとして計算した。）
⑧5.9070(µg)
⑨11.1124(µg)
⑫3.5(µg)
相対反応速度[V]
　生成したpNA量をAとおくと、
[V]
この式より、pNA量から相対反応速度[V]を求めることができた。
　⑧4.2764(nmol/µgトリプシン/hr)
　　⑨8.0449(nmol/µgトリプシン/hr)
　　⑫2.5338(nmol/µgトリプシン/hr)
基質濃度[S]
BAPNA濃度をBとおくと、
＝[S]
この式より、基質濃度[S]が求めることができた。
⑦⑫0(mM)
⑧⑬0.24(mM)
⑨⑭0.4(mM)
⑩⑮0.8(mM)
⑪⑯1.2(mM)
これらの表からわかるように、私の班では吸光度のデータがきちんと取れなかったためグラフが書けなかった。そのため８班のデータを引用し、もう１度データ処理した。
検量線 ①0.2324 ②0.5544 ③0.6842 ④0.9559 ⑤1.1906 ⑥1.3995 酵素活性 ⑦0.2434 ⑧0.7119 ⑨0.9635 ⑩1.4105 ⑪0.9986 ⑰1.3542 阻害活性 ⑫0.7160 ⑬0.5859 ⑭0.6043 ⑮0.6579 ⑯0.6553 ⑱0.6533
ブランクを引いた値(空気ブランクの値は大きいためデータとして不適)
検量線 0 0.322 0.4518 0.7235 0.9582 1.1671 酵素活性 0.011 0.4795 0.7311 1.1781 0.7662 阻害活性 0.48