連関資料 :: 実験
資料:274件
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DNA実験
- １．表題 分子生物学 基礎実験 そのⅠ ２．目的 細菌やカビがもつ、染色体とは独立に自己複製を行う核外遺伝子であるプラスミド。このプラスミドについて今回の実験では、プラスミドベクターと外来遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いて形質転換の実験とプラスミド調製の実験を通して形質転換とプラスミド調製の原理を知る。制限酵素で調製したDNAを切断し、アガロースゲル電気泳動で目的DNA断片（外来遺伝子）を確認する実験を通して制限酵素の意義を理解し、アガロースゲル電気泳動の原理を知る。 ３．材料と方法 Ⅰ．形質転換 材料：LB培地、アンピシリン（Amp）、0.1M塩化カルシウム、SOC培地、 X-gal（β―ガラクトシダーゼにより分解され青色に発色）、 IPTG（lacリプレッサーに結合し、LacZプロモーターからのLacZの転写を誘導するオペロンにおける誘導体として機能する。代謝によって分解されないので、ラクトースの代わりに使用する） pUC19（α断片をコードする遺伝子の途中にMCSがあり、このMCSの向きがpUC18とは逆になっている。Amp耐性遺伝子を持つ） pUC(3HBDH)19（pUC19に3HBDHという挿入遺伝子[インサートDNA]が存在する） JM109（α相補性が可能な宿主大腸菌。対数増殖期の初期ではOD₆₀₀=0.540である） 装置：高速遠心機、50ml遠心チューブ、1.5mlエッペンチューブ、インキュベータ 恒温水槽、卓上クリーンブース、ガスバーナー、マイクロピペット、チップ、 ボルテックスミキサー A）塩化カルシウム法（無菌実験であった） ①37℃で16－20時間培養（前培養）しておいたプレートより単一コロニー （直径2－3mm）をとる。 ②50ml遠心チューブに入った15mlLB培地に300μℓ前培養した大腸菌を植え継ぎ、これを37℃で2時間位、OD₆₀₀が0.4～0.8になるまで振とう培養する。 ③培養液を50ml遠心チューブに移し、0℃になるまで氷上で10分間冷却する。 →ここまでは用意されていた。 ④4000rpm、4℃で10分間遠心した。 ⑤卓上クリーンブース内でコニカルビーカー上清を捨てた。この際クリーンブース 内に持ち込む器具は70％エタノールで拭いた。50ml遠心チューブの蓋は火で炙った（滅菌処理）。 ⑥DNAの細胞膜表面への吸着を引き起こすため冷0.1M塩化カルシウムを1.5ml （750μℓ×2 ）加え、静かに攪拌してペレットを溶かした。氷上で15分間放置した。 ⑦4000rpm、4℃で10分間遠心した。 ⑧卓上クリーンブース内でコニカルビーカー上清を捨てた。1分間乾燥した。 ⑨冷0.1M塩化カルシウムを0.6ml （600μℓ×1 ）加え、静かに攪拌してペレットを溶かした。 →コンピテントセル作製 ⑩ピペットチップを使い、塩化カルシウムでのコンピテントセルをエッペンチューブに50μℓずつ分注した。（ピペットチップ、エッペンチューブは滅菌してあるものを使った）ここに、プラスミドDNA溶液を静かに加えた。（下表参照）氷中でチューブをかき回す程度に混合した。そのまま氷上で30分間放置した。 コンピテントセル50μl コンピテントセル50μl コンピテントセル50μl プラスミドDNAは何も入れない ｐUC19 50μl／ｍｌを5μl ｐUC（3HBDH）19 50μl／ｍｌを5μl 上記二つを混ぜる 上記二つを混ぜる 上記二つを混ぜる ⑪ヒートショックで細胞内にDNAを入れるため4
- レポート 理工学 DNA 形質転換 電気泳動
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フィルタの実験
- 考察 実験で用いたフィルタを受動フィルタと能動フィルタという点から考察してみる。 フィルタ?の実験で用いた定K型フィルタは抵抗、キャパシタ、インダクタなどの受動素子から構成されていたので、受動フィルタ呼ばれる。受動フィルタは、単に増幅素子（トランジスタ、オペアンプなど）を使用しないフィルタである。この点で、特定の伝達関数を（必要な素子数に関して）最も簡略に実現する。受動フィルタには他の利点もある。受動フィルタは能動素子を含んでいないので、電源が不要である。オペアンプによる帯域幅の制限を受けないので、非常に高い周波数でも正常に動作する。受動フィルタは、能動デバイスで処理できないような大きな電流や電圧レベルを伴う分野で使用できる。また、受動フィルタは、能動利得素子を使用した回路と比べてわずかな雑音しか発生しない。受動フィルタが発生する雑音は、単に抵抗素子からの熱雑音だけであり、注意深く設計すれば、この雑音の振幅も相当小さくできる。受動フィルタの欠点は、能動素子を使用しないので信号利得を与えることができないことである。非常に有用な受動フィルタを製造するには性能の良いインダクタが必要となるので高いコストがかかる。更に、複雑な受動フィルタは設計するのが難しく、時間がかかる。
- レポート 理工学 フィルタ 情報学 実験
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消毒実験
- 大腸菌及び大腸菌ファージを用いた塩素消毒実験を通して，その解析方法と結果の意味について考察する． 〈課題1〉 図3,4では，縦軸に微生物の生残率，横軸にCT値をとり，不活性化速度定数ｋの値を求めた．この図から，各班の塩素消毒でｋの値に差が出たことが分かる．最初に1.0ppmの塩素を加えた１班と3班で比較すると，1班よりも3班のほうがｋの値は小さかった．ここから，大腸菌ファージよりも大腸菌群で消毒効果が高かったと考えられる．大腸菌群よりも大腸菌ファージの方が塩素耐性が高いことが知られており，理論上，同じ塩素濃度なら大腸菌ファージのｋ値の方が小さくなるはずで，今回の結果はその予測通りだったといえる． また，2班のデータがないため4班と比較できないが，2.0ppmの塩素を最初に加えた場合でも同様に，大腸菌群よりも大腸菌ファージのｋ値の方が小さくなるはずである．
- レポート 理工学 大腸菌 ファージ 消毒 塩素 水
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DNA実験
- DNA実験 １、目的 制限酵素処理したDNAと未処理のDNAを用いて電気泳動を行い、その移動差を測定する。この移動差がプラスミドDNAのどのような違いに基づくものかを推定する。また、実験結果から制限酵素によりベクターがどのような作用を受けたかを調べる。 ２、材料と方法 Ⅰ制限酵素処理 まずマイクロピペットを用いて、プラスミドDNAを4μℓ、10x制限酵素用バッファーを2μℓ、H2Oを13μℓ、制限酵素１μℓをマイクロチューブに入れる。プラスミドDNAはa,bの２種類。制限酵素はEcoRⅠ、PstⅠの２種類を用意した。それぞれの組み合わせにより４種類のサンプルを作った。 １…a/Ec 2…a/Ps 3…b/Ec 4…b/Ps それぞれのサンプルは軽く撹拌して数秒程度遠心して37℃の恒温槽で1時間反応させた。反応させている間にアガロースゲルの作製を行った。 Ⅱアガロースゲル電気泳動 ア、アガロースゲルの作製 0.6ｇのアガロースの入った三角フラスコに泳動バッファー50ml加えて電子レンジで温めた。約60℃になったところでゲル作成台に流し込み約30分間放置した。ゲルが固まったところで、少量のH20を注いでコームを引き抜いた。 イ、泳動機のセッティング 泳動機に泳動バッファー400mlを加えてゲルを入れた。泳動機と電源をリード線でつないだ。 ウ、サンプルの添加 Ⅰの工程で反応させておいたサンプルを取り出し、10x泳動用サンプルバッファーを2μℓずつ加えて、撹拌、遠心を行った。また、未処理のプラスミドＤＮＡ a/bを3μℓとり、水を7μℓ加えて、10ｘ泳動用サンプルバッファー2μℓを加えた。（未処理のaをa´、未処理のbをｂ´とした） まず、分子量マーカー10μℓをゲルの穴の両端に添加した。その後、a´、a/Ec、a/Ps、b/Ec、b/Ps、b´の順に10μℓずつ添加した。 エ、電気泳動 全てのサンプルを添加したのち、泳動機の電圧を100Ｖに設定してスイッチを入れて約１時間泳動させた。 オ、ゲルの染色と観察 発泡スチロール容器にEtBr溶液を深さ１cmほど入れ、撹拌したのち、ゲルを台からはずして液につけた。約15分間染色した後、紫外線下で観察してポラロイド写真を撮影した。 ３、結果 Ⅰ分子量マーカーを泳動したレーンで観察されるＤＮＡの各バンドの移動差を測定し、片対数のグラフ用紙にプロットした。(図Ⅰ)7700bp以下の分子量ではほぼ一直線上になった。 Ⅱ制限処理したプラスミドDNAのレーンに見えるバンドの移動度を測定し、Ⅰで作製したグラフを利用して各バンドの分子量を推定した。（図Ⅱ） それぞれのサンプルのレーンで見られたバンドの位置と分子量(推定)を下に示した。 サンプル 泳動距離 分子量 a´ 2.10cm 2100bp a/Ec 1.75cm 3090bp a/Ps 1.75cm 3090bp 2.10cm 2100bp b/Ec 1.75cm 3090bp 2.42cm 1550bp b/Ps 1.47cm 4400bp b´ 1.70cm 3250bp ４、考察 Ⅰ、制限酵素処理のDNAと未処理のDNAの移動には明白な違いが現れた。プラスミドDNAのaにおいては。EcoRⅠで処理したものは泳動距離が短くなり、PstⅠ処理したものでは、泳動距離が短くなったものと、未処理のときと距離が変わらない２つのバンドが出現した。プラスミドDNAのbについては、EcoRⅠ処理し
- レポート 理工学 DNA 電気泳動 制限酵素
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タンパク質に関する実験
- 生物化学実験レポート タンパク質に関する実験 １．寒天ゲル電気泳動 pH8.6、4.3での泳動と染色・脱染色 11月20日：pH8.6での泳動と染色・脱染色 【目的】タンパク質の電気泳動では、両性電解質溶液を電気泳動すると陽極側が酸性、陰極側がアルカリ性になり、ここにタンパク質を加えると各タンパク質が等電点の順に並ぶ。荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する。移動中に pH 勾配があると、荷電が0となる点（ 等電点 ）で停止する。これが等電点電気泳動である。(電気泳動法は、DNAやRNAなど核酸を分離するのにも広く用いられており、分子生物学の基本技術のひとつといえる。)この 等電点 の違いにより物質を分離する等電点電気泳動(IEF)を、セルロースアセテート膜を担体として用いてTris Gly HCl 緩衝液pH8.6で試料タンパク質を分離する。アミドブラック－10Bの7％酢酸溶液でタンパク質を固定・染色し、7％酢酸で背景を脱染色してタンパク質の易動度を観察する。 【試薬と器具】〔試料〕Albumin(bovine serum)[分子量66.000、等電点4.7~4.9]、Hemoglobin(human blood)[分子量64.550、等電点6.8~7.0]、Lysozyme(egg white)[分子量14.300、等電点11.0~11.4] 以上のたんぱく質を0.6％NaCL溶液(0.02％NaN3を含む)に4mg/ml(0.4％)になるように溶解した溶液を使用する。 〔担体〕セルロースアセテート膜：1枚 〔pH8.6緩衝液〕Tris:30.29g Gly:7.51g HCl:1N42g DW:1L buffer〔マーカー〕Bromphenol blue（BPB）0.1％水溶液、Metyl green(MG) 0.1％水溶液 〔染色液〕Amido Schwartz 10B 0.2％脱染色液溶液 〔脱染色液〕7％酢酸水溶液 DW、泳動槽、ろ紙、ピンセット、ガラス板 【方法】１）セルロースアセテート膜を槽にセットし(ろ紙で足りない部分はブリッジ)、短冊状に切ったろ紙を緩衝液に浸した後、ガラス板上のセルロースアセテート膜と電極槽を接続した。 ２）約1×10mlのNO.2ろ紙を試料に浸し、キムワイプで過剰の試料を取り除き、セルロースアセテート膜の極側に長辺が平行になるよう密着させて置いた。また試料を置いた場所をマークするため、墨汁とろ紙片と並べてスポットした。 ３）マーカーのBPB溶液とMG溶液は、2×2mmのNO.2ろ紙を用いて試料と同位置に試料と重ならないようにセルロースアセテート膜上にスポットした。 ４）150V・30分間、泳動槽で泳動させた。 ５）泳動終了後、セルロースアセテート膜を染色槽に入れ、約2分間染色した。 ６)メンブレンを傷つけないように染色液から脱染色液(7％酢酸水溶液)に移し、槽を穏やかにゆすった。また液は３回交換した。 ７)アセテートセルロース膜を、ガラス板に載せ乾燥させた。 【結果】 pH8.6 150V・30分間 泳動槽で泳動させたら、Hemoglobinは＋側に1.2㎝、Lysozymは －側に3.3㎝、BSAは＋側に2.2㎝動いた。 表１ タンパク質 等電点 等電点－緩衝液のpH 移動方向 移動距離(cm) Hemoglobin 6.8～7.0 －1.6～－1.8 ＋ 1.2 Lysozym 11.0～11.4 2.4～2.8 － 3.3 BS
- レポート 理工学 タンパク質 等電点 pH
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