連関資料 :: タンパク質の定量
資料:5件
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タンパク質の定性と定量
- 【目的】 定性実験からタンパク質の性質を理解し、定量実験から比色法の原理を理解する。 【操作・結果】 ～定性実験～ 卵白溶液2mlを試験管に取り、飽和硫酸アンモニウム液を加え、何mlで沈殿が生じるか調べた。 （ 2.2 ）ml 2本の試験管に卵白溶液をそれぞれ2ml加え、１本の試験管はそのままで、もう１本の試験管には希酢酸3滴を加えた。この2本の試験管を80℃の湯浴につけ、凝固が生じるまでの時間を測定した。 卵白溶液（ 32 ）秒 酢酸添加溶液（ 55 ）秒 c) 卵白溶液2mlにエタノールを静かに加えていき、何mlで白濁が生じるかを調べた。 （ 0.5 ）ml d) 卵白溶液と検体(ア)、 (イ) 各2mlずつを別々の試験管に入れ、0.1%ニンヒドリン溶液1mlをそれぞれに加え、これらを80℃の水浴中で3分間加熱し、色の変化を観察した。 これを（ ニンヒドリン ）反応という。 卵白溶液（ 白濁した紫 ）色 検体(ア)（ うすい紫 ）色 検体(イ)（ 透き通ったオレンジ ）色 e) 卵白溶液2mlを試験管に取り、濃硝酸1mlを静かに加えた。 （ 白色沈殿 ）を生じた。 次にこれを80℃の水浴中に入れた。 （白濁した黄色）になった。 さらにこれを冷却させ、5%水酸化アンモニウム溶液でアルカリ性にした。 （ 濃い黄色 ）に変わった。 これを（ キサントプロテイン ）反応という。 f) 卵黄液2mlと卵白溶液2mlを各2本の試験管に入れた。卵黄液1本と卵白溶液1本をセットとし、一方は80℃の湯浴に、他方は65℃の湯浴に入れ、それぞれ30分加熱し変化を見た。 観察結果（ 卵黄･･･80度で固まった。60度では固まりかけた。） （ 卵白･･･60度に比べ80度の方が白かった。） g) 2.4%スキムミルク50mlを100mlビーカーに入れ、0.1N塩酸を沈殿が生じるまで滴下し、このときのpHを調べた。 pH（ 6.5 ） さらに塩酸を、溶液のpHが4.6になるまで加えた。 （ 白色の細かな粒々状の沈殿物が生じた。 ） ・定量実験 タンパク質量 （ｍｇ） 吸光度 吸光度の平均 ブランク 0 0.091 0.0865 0 0.082 アルブミン （７０ｍｇ/ｍｌ） 7 0.405 0.410 7 0.415 14 0.709 0.715 14 0.721 28 1.184 1.2035 28 1.223 42 1.210 1.187 42 1.164 検体（ウ） 下記に記入 0.887 0.8735 〃 0.860 検体（エ） 〃 0.857 0.7925 〃 0.728 検体(ウ)のタンパク量：0.787 = 0.028x + 0.4488 x = 12.07857143≒12.1（mg/200μl） 検体(エ)のタンパク量：0.706 = 0.028x + 0.4488 x =9.185714286≒9.2（mg/200μl） ～最小二乗法による直線の式～ 【考察】 定性実験において、タンパク質は試薬を加えたり加熱したりすることにより、タンパク質の構造を維持する水素結合が切れ、タンパク質が変性して、沈殿が生じると考えられるが、アミノ酸の配列順序が変化するわけではないと考えられる。一度変性してしまうと元の状態に戻すことが非常に困難である。これは水素結合というのは共有結合に比べればはるかに弱い結合であるからであるからと考えられる。 a)で沈殿が生じたのは、飽和硫酸アンモニウム飽和硫酸アンモニウムが非常
- タンパク質 定性 定量
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遺伝子組み換えタバコからのタンパク質の抽出、タンパク質定量とSDS-PAGE
- 遺伝子組み換えタバコからのタンパク質の抽出、 タンパク質定量とSDS-PAGE 実験日 6月29日、30日 目的 遺伝子組み換えタバコからタンパク質を抽出し、吸光度測定によってタンパク質を定量する。次にタンパク質をSDS-PAGEによって電気泳動する。 原理 タンパク質の抽出：タバコの葉からタンパク質を抽出する場合、まず、界面活性剤であるSDSをを含まない緩衝液で抽出し、可溶性タンパク質画分を得る。続いて、抽出残蹉渣を含む緩衝液で抽出し、膜タンパク質を可溶化する。 タンパク質の定量(ブラッドフォード方)：色素Coomassie brilliant blue G250の賛成溶液の最大級光度が、色素がタンパク質に結合すると465nmから595nmに移動することを原理としている。色素は主に塩基性と芳香族のアミン酸残基に結合する。結合する色素の量はタンパク質の量に比例するので、色素の595nmの吸収を測定することによってタンパク質質量を求めることができる。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE) : タンパク質を2-メルカプトエタノール処理をしてS-S結合を切断、ポリペプチド鎖に解離し、さらにSDS（ラウリル硫酸ナトリウム）で変性後、電気泳動し、分子量によって分離する。 実験材料 実験1 抽出緩衝液Ⅰ(125mMTris-HCl / pH6.8) 1ml 抽出緩衝液Ⅱ(125mMTris-HCl / pH6.8 , 4%SDS) 1ml 実験2 BSA標準溶液 (10 ) 10ml 蒸留水 Dye reagent 3ml 実験3 分離ゲルバッファー (1.5 M Tris-HCL/pH8.8 , 0.4% SDS) 30%アクリルアミドストック溶液（29.9％ アクリルアミド , 0.8% N,N’-メチレンビスアクリルアミド） 1.5％過硫酸アンモニウム TEMED (N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン) 濃縮ゲルバッファー (0.5M Tris-HCl / pH6.8 , 0.4%SDS) 10X 泳動バッファー組成 (250 mM Tris-HCl / pH8.8 , 1.92 M グリシン , 1%SDS) 2X サンプルバッファー (20% Glycerol , 4%SDS , 125mM Tris-HCl / pH6.8 , 12% メルカプロエタノール , 0.004％BPB) 固定液 (メタノール 100ml , 酢酸 20ml , 脱イオン水 80ml) 染色液 (染色液 A 30ml , 染色液B 30ml) タンパク質分子量マーカー Phosphorylase B 113,000 Bovine serum albumin 92,000 Obalbumin 52,300 Carbonic anhydrace 35,300 Soybean trypsin inhibitor 28,700 Lysizyme 21,300 実験方法 実験1 タバコ葉からの蛋白質の抽出 野生型タバコおよび遺伝子組み換えタバコの葉から、2cm四方ぐらいの切片を切り出し、エッペンチューブに入れた。 200μlの抽出緩衝液を入れ、ぺっセルで完全にすりつぶした。 遠心 (15000rpm, 5min) し、上澄み液を新しいエッペンチューブに移した。抽出緩衝液Ⅰには界面活性剤が入っていないので可溶性タンパク質のみが抽出された。これが可溶性タンパク質画分となる。 沈殿に200μlの抽出緩衝液Ⅱを加え、ペッセルで葉を完全にすりつぶし、遠心
- レポート 理工学 遺伝子組み換えタバコ タンパク質 SDS-PAGE
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荷電の差に基づく卵白タンパク質の分離・精製タンパク質の定量
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セミミクロケルダール法による総窒素および粗タンパク質の定量
- 目的 試料（きな粉）に含まれているＮ含量及び粗タンパク質をセミミクロケルダール法により定量する。 実験操作 １）試料の分解 きな粉約40mgを精密に量り200mLのケルダール分解フラスコに入れた。 これに分解促進剤0.5g、H2SO4 3mLを加え、フラスコを揺り動かしながら30％H2O2溶液1mLを加えた。 補足）分解促進剤：CuSO４・５H２O − K２SO４（１：４） これをドラフト内のケルダール分解装置にて100Wで加熱した。 試料が炭化がしたら200Wにして煮沸し、分解液が淡青色透明になってから、1時間加熱した。 冷却後、分解液に水20ｍＬを徐々に加え、分解フラスコを蒸留装置に装着した。 ２）蒸留 蒸留装置の吸収フラスコに0.05N H２SO４10.0mlを入れ、これにブランスウィック試液３滴を加え、冷却器の先端は液面下に浸しておき、小漏斗から30％NaOH溶液25mLを加えた。 補足）ブランスウィック試液：メチルレッド0.2gおよびメチレンブルー0.1gをエタノール300mLに溶かしろ過したもの。 ついで水蒸気発生器から水蒸気を通じて導入し、留液約100mLを留取したのち、冷却器の先端を液面から離した。 さらに留液数mL を留取し、ついで冷却器の先端内外壁を少量の水で受器内に洗いこんだ。 考察 今回の実習では、ドラフトが故障したため分解液の色を淡青色透明になるまで行かなかった。またH２O２溶液を加えた際、振り続けたため、白い泡を発生した。課題 問１ この方法で得られた値を粗タンパク質というが、その理由は？ 問２ 分解促進剤や過酸化水素水の役割を述べよ。 問４ 本法で定量可能な窒素化合物および定量不可能な窒素化合物を挙げ、その理由について述べよ。 問５ 濃硫酸の役割について述べよ。
- レポート 医・薬学 きな粉 総窒素 粗タンパク セミミクロケルダール法
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