連関資料 :: 酵素
資料:21件
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酵素電極法
- 目的 オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、呼吸など、酸素消費を伴う酵素反応の活性を測定するのに、酸素電極法がよく用いられる。今回の実習ではClark型酸素電極を用いてグルコース酸化酵素活性の呼吸活性を測定し、酸素電極法について学ぶ。 原理 ●Ｃｌａｒｋ型酸素電極 各種の様式の酸素電極が考案されているが、ポーラログラフィーの原理で液体または気体中のO₂濃度を電気的に測定するClark型電極は、アクリル樹皮製の円筒状の先端に、Pt電極とAg-AgCｌ電極がふうにゅうされ、先端部分をテフロンなどの薄膜で覆い、両極のブリッジとしてKCL液が満たされている。電極内液および反応液のK＋、Cｌ−や各種イオンなどはこの薄膜を通ることができないが、反応液のO₂は陰極であるPt電極に達し、次のような電気化学的反応を受ける。 O₂＋２H₂O＋４e- → ４OH− ４OH−＋４H＋ → ４H₂O すなわち O₂＋４H＋＋４e- → ２H₂O 陽極では ４Ag＋４Cl− → ４AgCl＋４e- となり、両極間に反応液のO₂濃度に応じた電解電流が流れ、全体の反応は、 O₂＋４Ag＋４H＋４Cl− → ４AgCl＋２H₂O ・・・? となる。 実験手順 ?Ｃｌａｒｋ型酸素電極および恒温槽の準備をした。 ?スターラを作動させ、目盛りを合わせた。 ?下記の実験計画にしたがって実験を行った。GODを加えるのは、反応開始前に加えるべき試薬を全て加えた後、2〜3分放置してセル内が温度平衡に達してペンが安定し、セル内に気泡が残っていないことを確認してから行った。 ?Exp.1〜5の実験を順次行い、経過を観察した。
- レポート 医・薬学 Clark型酸素電極 グルコース酸化酵素 酸素電極法
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酵素科学実験
- 酵素科学実験（タンパク質の精製・酵素学実験） 【実験目的】 酵素の精製法及び活性の測定方法を身につける。 酵素活性の単位について理解する。 【実験方法】 実験Ⅰ 酵素活性の測定 ＜使用試薬＞ 0.5M Tris-HCl Buffer (pH8.5) ，L-カルニチン溶液 (50mM) 発色剤 ，酵素液 ，NAD溶液(5mM) ，0.5N HCl ＜操作＞ ・・・ 実験Ⅱ 反応時間と基質変化量の関係 ＜使用試薬＞ 0.5M Tris-HCl Buffer (pH8.5) ，L-カルニチン溶液 (50mM) 発色剤 ，酵素液(A＝×3200 B=×800) ，NAD溶液(5mM) ，0.5N HCl ＜操作＞ 実験Ⅲ イオン交換クロマトグラフィー ＜使用試薬＞ 陰イオン交換樹脂（DEAE-トヨパール） 平衡化用Buffer（10mM リン酸カリウムBuffer pH7.5 ＋ 2-メルカプトエタノール） 溶出用Buffer(0.2M KCl , 0.4MKCl) 酵素粗抽出液 , 0.5M Tris-HCl Buffer (pH8.5) ，L-カルニチ
- 酵素 精製 酵素活性 unit PAGE イオン交換クロマトグラフィー
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酵素の反応速度論
- 酵素の反応速度論 実験日 7月5日 目的 α_アミラーゼの活性測定を行い、酵素反応の最大速度（Vmax）とミカエリス定数 (Km)を求める。 原理 ミカエリスメンテンの理論 : 酵素の反応速度 (v) と気質濃度 (S) との関係は、まず基質濃度が低いときは、ほぼ直線関係を示し1次反応に従う。次に、これよりも濃度を増やしていくと、増した分だけ速度が得られなくなり、更に増すと、反応速度は最大値に達して基質濃度と無関係に一定となり、0次反応を示すようになる。この0次状態における酵素反応速度を最大速度 (Vmax) と呼び、その半分の速度 (1/2Vmax)を与える基質濃度をミカエリス定数 (Km) という。これは下記の式の関係にある。 このミカエリスメンテンの式を変形すると、次のような式が得られる。 この式は、1/vおよび1/[S]を関数として直角座標上にプロットすると、直線が得られ、その直線とXおよびY座標軸との交点から、VmaxとKmを求めることができる。 実験材料 1%可溶性デンプン 6ml 緩衝液 : 0.1M リン酸緩衝液 pH6.0 10ml α_アミラーゼ : 2mg/100
- レポート 理工学 酵素 反応速度 α_アミラーゼ ミカエリス定数
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トリプシン酵素活性の測定
- 【目的】 N－α－benzoyl－p－nitroanilideを基質として一定時間反応させた後、分解されて生じたp－nitroanilineの量を405nmの吸光度を測定することによって分解の程度を求める。 また、トリプシンインヒビターの阻害作用をLineweaver－Burkプロットで解析し、その阻害様式を調べる。これらにより、基質濃度を変えたときの酵素反応を調べる。 【方法】 a. マイクロピペットを用いて、ガラス試験管にテキストの表の割合で、試薬を入れていった。 b. 緩衝液を加え、最後にトリプシンを加え、混ぜた。 c. 恒温槽37℃で30分間静置し、反応させた。 d. 恒温槽より取り出し、反応を止めるために45%酢酸250μlを加えた。 e. 吸光度を測定するために、マイクロプレートに200μlずつ入れた。 f. マイクロプレート比色計で405nmの吸光度を測定した。 【結果】 吸光度のデータ 検量線 ①0.2685 ②0.5512 ③0.5828 ④0.8065 ⑤0.9465 ⑥1.0368 酵素活性 ⑦0.2883 ⑧0.681 ⑨0.8153 ⑩0.3425 ⑪0.306 ⑰0.2611 阻害活性 ⑫0.6189 ⑬0.3037 ⑭0.2831 ⑮0.284 ⑯0.3276 ⑱0.2592 ブランクと空気ブランクの平均を引いた値 検量線 ①0 ②0.0226 ③0.0542 ④0.2779 ⑤0.4179 ⑥0.5082 酵素活性 ⑦⁻0.2404 ⑧0.1524 ⑨0.2867 ⑩⁻0.1862 ⑪⁻0.2227 － 阻害活性 ⑫0.0903 ⑬⁻0.2250 ⑭⁻0.2456 ⑮⁻0.2447 ⑯⁻0.2011 － pNA量(µg) Y＝0.0258xに吸光度を代入し、酵素活性・阻害活性のpNA量(µg)を出した。 （しかし、何らかの原因により酵素活性、阻害活性の吸光度にマイナスの値が出たためデータとして不適であるのでプラスの値のみデータとして計算した。） ⑧5.9070(µg) ⑨11.1124(µg) ⑫3.5(µg) 相対反応速度[V] 生成したpNA量をAとおくと、 [V] この式より、pNA量から相対反応速度[V]を求めることができた。 ⑧4.2764(nmol/µgトリプシン/hr) ⑨8.0449(nmol/µgトリプシン/hr) ⑫2.5338(nmol/µgトリプシン/hr) 基質濃度[S] BAPNA濃度をBとおくと、 ＝[S] この式より、基質濃度[S]が求めることができた。 ⑦⑫0(mM) ⑧⑬0.24(mM) ⑨⑭0.4(mM) ⑩⑮0.8(mM) ⑪⑯1.2(mM) これらの表からわかるように、私の班では吸光度のデータがきちんと取れなかったためグラフが書けなかった。そのため８班のデータを引用し、もう１度データ処理した。 検量線 ①0.2324 ②0.5544 ③0.6842 ④0.9559 ⑤1.1906 ⑥1.3995 酵素活性 ⑦0.2434 ⑧0.7119 ⑨0.9635 ⑩1.4105 ⑪0.9986 ⑰1.3542 阻害活性 ⑫0.7160 ⑬0.5859 ⑭0.6043 ⑮0.6579 ⑯0.6553 ⑱0.6533 ブランクを引いた値(空気ブランクの値は大きいためデータとして不適) 検量線 0 0.322 0.4518 0.7235 0.9582 1.1671 酵素活性 0.011 0.4795 0.7311 1.1781 0.7662 阻害活性 0.48
- トリプシン 酵素活性
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酵素の反応速度論
- 酵素実験1 目的 私たちの体は摂取した食物を多くの化学反応で変化させながら生命を維持しているこれら無数の反応は、触媒としての酵素の働きにより速やかに進められている。例えば消化酵素で分解したときの速度は、酵素を使わずに分解するよりも数十万倍も速くなる。 酵素反応にはいろいろな特徴がある。この実験では酸性ホスファターゼを用いて、酵素反応の時間経過および基質濃度と反応速度との関係を理解する。 結果 p-NPの検量線 p-NP濃度 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 吸光度 0.0862 0.18375 0.3372 0.5058 0.585 0.68825 検量線の式：y=2.676888x+0.051935 A=2.728823 実験１ ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 吸光度 0.1113 0.0232 0.1249 0.2062 0.1858 0.3098 B(①+②) 0.1345 0.1345 0.1345 0.1345 0.1345 0.1345 補正吸光度(各吸光度-B) -0.0096 0.0717 0.0513 0.1753 p-NP生成量(mM) -0.00035 0.0026 0.0018 0.0064 実験2 試験管番号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ 基質濃度(mM) 2 2.5 3 4 5 1/〔S〕 0.5 0.4 0.33 0.25 0.2 吸光度 0.0269 0.0809 0.1169 0.1226 0.1238 0.1739 0.1688 C=①+② 0.1078 0.1078 0.1078 0.1078 0.1078 0.1078 補正吸光度 0.0091 0.0148 0.0160 0.0661 0.0610 p-NP生成量(mM) 0.2483 0.4039 0.4366 1.8038 1.6646 反応速度v 0.0236 0.0385 0.0416 0.1718 0.1585 1/v 42.373 25.974 24.038 5.8207 6.3091 -1/Km=0.16863 Km=-5.93014 1/Vmax=-21.05962 Vmax=-0.04748 考察 試験管①には緩衝液の他にp-NPPが入っているが酸性ホスファターゼは入っていない。また試験管②には緩衝液の他に酸性ホスファターゼが入っているがp-NPPは入っていない。このような実験を盲検という。③④⑤⑥の吸光度から①と②の吸光度を足した値を差し引いた値が酵素により発色した真の値となる。酵素反応時間とともに、p-NPPが分解して生じたp-NPが発色して吸光度が上昇した。 基質濃度を変えて、酵素反応を調べると、基質濃度が低いときには基質濃度と反応速度は比例して直線関係となるが、基質濃度が高くなると反応速度は一定となってくる。この関係を式で示したのがMichaelis・Mentenの式である。反応速度の逆数を基質濃度の逆数に対してグラフに目盛り、全ての点から最も距離が近い曲線(回帰直線)を引いて、X軸との交点を求めるとその数値は1/Vmaxを示し、Y軸との交点は-1/Kmを示すこのプロットをLineweaver・Burkのプロットという。Kmは基質と酵素との親和性を示し、値が小さいほど基質との親和性は大きい。Vmaxは最大反応速度を示し、これ以上基質濃度が上昇しても酵素の仕事量が限界に達していることを示している。 悩んでみ
- レポート 農学 酵素 反応速度論 阻害剤
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酵素実験レポート 評価：A＋
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アセトアルデヒド脱水素酵素の遺伝子診断
- 近年の生命科学の発展により、医歯学の分野においてもヒトゲノム情報に基づいた診断や治療が急速に発達している。今回の実習では、実際にゲノム解析の一端を体験し、ヒトゲノムの構造と昨日を理解した上で、その医療への応用について理解を深める。 具体的には、アルコールの代謝に関与するアルデヒド脱水素酵素2（Aldehuyde dehydrogenase 2, ALDH2）の遺伝子型について、各自、自分のDNAサンプルを用いて判定する。ALDH2遺伝子には東洋人に多い特定の変異（塩基置換）が知られており、他の人種に比べてアルコールに弱い人が多い原因の1つとされている。今回の実験ではこの変異型遺伝子と正常型との間で置換している部分を含むPCRプライマーを利用し、PCR増幅の有無を調べることで遺伝子型を判定する。ALDH2活性酵素の簡易判定法であるアルコールパッチテストも行い、これらの判定結果をあわせて考察する。 これらの実験を通して、ゲノムDNAの構造やPCRの原理を理解し、どのように遺伝子型の区別を行なっているのかを認識する。また、表現型と遺伝子型との関係や親から子への遺伝様式について理解を深める。
- 生化学 分子生物学 ALDH2 PCR DNA 遺伝子 ゲノム
- 1,650 販売中 2013/04/08
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