資料紹介
【目的】
赤血球、血清、脳に含まれる脂質成分をTLC法を用いて調べる。
【方法】
全脂質の抽出
ブタ赤血球、ブタ血清、ブタ脳の凍結乾燥粉末10mgを計り取った大マイクロチューブにクロロホルム/メタノールを(2:1)1mlをマイクロピペットで加えた。混合後、ヒートブロックで40℃、20分間加熱した。
小型遠心機で10分間遠心し、上層を別のマイクロチューブに移した。
液量をクロロホルム/メタノール(2:1)で1mlに調節し、混合後、0.5mlを別のマイクロチューブに移した。
1本には水200µlを加え、小型遠心機で5分間遠心し、上層を除き、下層の体積をクロロホルム/メタノール(1:1)で500µlに調節した。これを全脂質抽出液とした。
エステル含有脂質の分解
別の1本に0.1MNaOH-メタノール200µlを加え、40℃で30分間加熱し、エステル含有脂質を分解した。分解後、1M酢酸-メタノール100µlを加えて中和し、水200µlを加え混合した。小型遠心分離機で5分間遠心後、上層を除き、下層の体積をクロロホルム/メタノール(1:1)で500µlに調節した。これをアルカリ処理脂質抽出液とした。
得られた全脂質抽出液、アルカリ処理脂質抽出液、各20µlを3本ずつ、小マイクロチュ－ブにとった。
薄層クロマトグラフィー(TLC)による脂質の分解
スタンダードにはクロロホルム/メタノール(1:1)15µlを加え、全量をスポットした。また3枚のTLCプレートにガラスキャピラリーを用いて、全脂質抽出液、アルカリ処理脂質抽出液をスポットした。
スポット後のプレートを、プレート①はヘキサン/ジエチルエーテル/酢酸(80:30:1)を、プレート②、③はクロロホルム/メタノール/水(65:38:1)を展開溶媒として上から1cmの所まで展開させた。
プレートを風乾後、プレート①、②は酢酸銅-リン酸試薬、プレート③はオルシノール硫酸試薬をスプレーし、ホットプレートで加熱して発色させた。
【結果】
プレート①
成分 Rf値
1.コレステロールエステル 0.79
2.脂肪酸メチルエステル 0.61
3.遊離脂肪酸 0.18
4.コレステロール 0.12
プレート②
1.コレステロールエステル 0.92
2.脂肪酸メチルエステル 0.87
3.コレステロール 0.76
4.ガラクトシルセラミド 0.58
5.ホスファチジルエタノールアミン 0.52
6.スルファチド 0.34
7.ホスファチジルコリン 0.30
8.スフィンゴミエリン 0.22
(プレート②では操作ミスで、脳アルカリ処理脂質と
血液全脂質のスポットの位置が逆になってしまった。)
プレート③
1.脂肪酸メチルエステル 0.89
2.コレステロール 0.80
3.ガラクトシルセラミド 0.63
4.ホスファチジルエタノールアミン 0.52
5.スルファチド 0.44
6.グロボシド 0.25
脂質 脳 血清 赤血球 コレステロールエステル
脂肪酸メチルエステル
遊離脂肪酸
コレステロール
ホスファチジルエタノールアミン
ホスファチジルコリン
スフィンゴミエリン
ガラクトシルセラミド
スルファチド
グロボシド ＋
＋＋＋
＋
＋＋＋
＋＋
＋＋
＋
＋＋
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【目的】
赤血球、血清、脳に含まれる脂質成分をTLC法を用いて調べる。
【方法】
全脂質の抽出
ブタ赤血球、ブタ血清、ブタ脳の凍結乾燥粉末10mgを計り取った大マイクロチューブにクロロホルム/メタノールを(2:1)1mlをマイクロピペットで加えた。混合後、ヒートブロックで40℃、20分間加熱した。
小型遠心機で10分間遠心し、上層を別のマイクロチューブに移した。
液量をクロロホルム/メタノール(2:1)で1mlに調節し、混合後、0.5mlを別のマイクロチューブに移した。
1本には水200µlを加え、小型遠心機で5分間遠心し、上層を除き、下層の体積をクロロホルム/メタノール(1:1)で500µlに調節した。これを全脂質抽出液とした。
エステル含有脂質の分解
別の1本に0.1MNaOH-メタノール200µlを加え、40℃で30分間加熱し、エステル含有脂質を分解した。分解後、1M酢酸-メタノール100µlを加えて中和し、水200µlを加え混合した。小型遠心分離機で5分間遠心後、上層を除き、下層の体積をクロロホルム/メタノール(1:1)で500µlに調節した。これをアルカリ処理脂質抽出液とした...
