唾液分泌（ラット耳下腺腺房細胞からのアミラーゼ分泌）

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資料紹介

2006/11/06-07
実験題目：唾液分泌（ラット耳下腺腺房細胞からのアミラーゼ分泌）
実験者：windowsxp
共同実験者：Mac
目的・緒言：
唾液腺房細胞からのアミラーゼ分泌はムスカリン様受容体もしくはα1アドレナリン受容体、
Substance P受容体が刺激を受けて細胞内カルシウム濃度が上昇することで、またはβアドレナ
リン受容体が刺激を受けて細胞内 cAMP濃度が上昇することで活性化される。今回の実験では AC
ｈでムスカリン様受容体を、Isoproterenol でβアドレナリン受容体をたたきそれぞれの系での
アミラーゼ分泌を測定する。
唾液腺は自律神経の二重支配を受けている。副交感神経は延髄の下唾液神経核から舌咽神経を
経て耳神経節に至り、ここから耳下腺を支配する。また延髄の上唾液神経核から顔面神経、鼓索
神経、舌神経を経てから、腺の近傍でニューロンを変えて顎下線おとび舌下腺を支配する。交感
神経系は T1～T4から出て、上顎神経節でニューロンを変えて唾液腺を支配する。
図 1 腺房細胞の唾液分泌の機序
材料：ラットの耳下腺
試薬：HEPES buffer、コラゲナーゼ typeⅡ、BSA、ACh および Isoproterenol、基質緩衝液 1 ml
（0.4 mg のデンプンを含む）、発色試薬
手順：
1．安楽殺したラットから唾液腺（耳下腺）を採取した。
2．HEPES bufferを入れたシャーレ内で耳下腺から脂肪組織およびリンパ節等をできるだけ取
り除いた。
3．耳下腺を小鋏で細断した(約 400 回)。
4．細胞分離液（コラゲナーゼ typeⅡ・BSA1％を含む HEPES buffer）5ml 入りの小フラスコ
にミンチ状にした耳下腺を入れ、100％酸素を 10 秒間通気した後、15 分ごとに軽くピペッテ
イングしながら 37℃で 30 分間インキュベーションした。
5．フィルターユニットを用いて細胞分離液を濾過した。
6．400G× 10 秒で遠心した後、上清を捨てた。さらに 5ml の BSA入り HEPES bufferを加え
てピペッテイングし、遠心した。この操作をもう一度繰り返した。
7．2 回目の遠心上清を捨てた後、BSA入り HEPES bufferを 5ml 加えた。ピペッテイングし
た後に細胞懸濁液を新しい三角フラスコに移し 37℃で 30 分間インキュベーションした。
8．細胞懸濁液を遠心管に移し、400G× 10 秒で遠心した。
9．ペレットを巻き上げないように注意しながら、上清を取り除いた。
10．3ml の BSA 入り HEPES bufferを加え､ゆっくりとピペッテイングしながら 3 本の test
tube(No.1-3)にそれぞれ 1ml ずつ分注した（下表）。
11．No.2および 3 の tube にそれぞれ ACh および Isoproterenol の Stock solution を 3μ|加え
た。これらを 37℃で 30 分間インキュベーションした。
12．インキュベーション終了後、400G× 10 秒で遠心し、上清から 500μ|採取しサンプチュー
ブに移し氷上で保存した（下表）。
Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5
Control + ACh + Isoproterenol
蒸留水 HEPES+BSA
※ACh、Isoproterenol は加えた時点で